Фламинго живут до 80 лет.

Транскрипт

1

2 1. Назначение и область применения Настоящая лабораторная методика предназначена для получения РНК из единичных эукариотических клеток и пробоподготовки РНКовых библиотек для анализа с использованием секвенатора следующего поколения "Ion Proton". 2. Принцип методики Методика основана на манипуляции с единичными эукариотическими клетками, после лизиса которых и выделения тотальной РНК проводится последовательное получение одноцепочечных кднк, а затем двухцепочечных ДНК всех матричных РНК, которые могут быть проанализированы с использованием высокопроизводительного секвенирования. 3. Оборудование и материалы Оборудование Автоматические пипетки (Eppendorf, США) Центрифужный испаритель Concentrator plus (Eppendorf, США) Настольная центрифуга Eppendorf 5415R с охлаждением (Eppendorf, США) Настольная центрифуга MiniSpin Plus (Eppendorf, США) Флуориметр Qubit 2.0 (Invitrogen, США) Спектрофотометр NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) Анализатор качеств нуклеиновых кислот BioAnalyzer 2100 (Agilent, США) Магнитный штатив DynaMag-2 (Invitrogen, США) Магнитный штатив Magnetic Stand-96 (Life Technologies США) Магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) Микроманипулятор TransferMan NK2 (Eppendorf, США) ПЦР амплификатор Verity (Applied Biosystem, США) 3.2. Материалы Набор Ion Xpress Plus Fragment Library Kit (Life technologies, США) Набор Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit (Life technologies, США) Набор Qubit dsdna HS Assay Kit (Invitrogen, США) Ion Plus Fragment Library Kit (Invitrogen, США) Ion Plus Fragment Library Adapters (Invitrogen, США) Ion Library Equalizer Kit (Invitrogen, США) Набор Qubit dsdna BR Assay Kit (Invitrogen, США)

3.2.8. Пробирки Non-Stick RNase-Free Microfuge tubes 0.5, 1.5 мл (Thermo Fisher Scientific, США) 3.2.9. Набор обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen, США) 3.3.0. Пробирки Qubit Assay Tubes (Invitrogen, США) 3.

3 Пробирки Non-Stick RNase-Free Microfuge tubes 0.5, 1.5 мл (Thermo Fisher Scientific, США) Набор обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen, США) Пробирки Qubit Assay Tubes (Invitrogen, США) Пробирки LoBind tubes 1.5 мл (Eppendorf, США) Набор Agilent High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies, США) Набор PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen, США) Химические реактивы Sigma-Aldrich (США) Наконечники объемом 10, 20, 200, 1000 мкл с фильтром OmniTip (ULPlast, Польша) 4. Методика приготовления библиотек 4.1. Получения кднк из тотальных РНК Единичную эукариотическую клетку получают из гетерогенной популяции при помощи стеклянной пипетки микроманипулятора под световым микроскопом (рисунок 1). Рисунок 1. Отбор эукариотических клеток при помощи микроманипулятора. А - подбор клетку, В, С - отбор клетку. Полученную клетку центрифугируют и хранят при -80 С или на льду для немедленного использования. Клетки лизируются в гипотоническом растворе, содержащем детергент и ингибитор РНКазы для того, чтобы получить тотальную РНК. Более 90% РНК клетки состоят из некодирующих трнк и ррнк, поэтому с использованием случайных праймеров с анкорными последовательностями (поли-а) и обратной транскриптазы SuperScript III из всех кодирующих мрнк получают первую копию одноцепочечных кднк. После ингибирования обратной транскриптазы при 70 С и удаления неиспользованных праймеров к 3' концу полученной одноцепочечной кднк добавляются поли А хвост путем лигирования. Затем, удаляются РНК при помощи фермента РНКазы. Вторичную цепь 2

4 кднк синтезируют с использованием поли Т праймера с другими анкорными последовательностями при помощи ПЦР. После очистки еще раз амплифицируются кднк с блокирующих анкорных последовательностей. ДНК очищаются и используются для получения библиотеки для секвенирования Конструирование транскиптомной библиотеки Конструирование библиотеки осуществляют согласно рекомендациям производителя. На начальном этапе ДНК клетки, полученные из РНК, фрагментируются в течение 20 мин при помощи фермента (Ion Shear Plus Enzyme Mix) для того, чтобы получить фрагменты длиной п.о. Затем следует последовательные этапы очистки ДНК фрагментов от ферментов и фрагментов с большей и меньшей длиной. Первый этап очистки проводят при помощи добавления 1,8 объема магнитных частиц Agencourt AMPureXP (Backman Coulter, США). На втором этапе магнитные частицы с налипшей на них ДНК очищают 70% этанолом и элюируют в воде без нуклеаз на магнитном штативе DynaMag-2 (Invitrogen, США). Количественное содержание полученной ДНК измеряют с использованием флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США), качественное содержание ДНК поверяют при помощи биоаналайзера и dsdna HS Assay Kit (Agilent, США) (рисунок 2) согласно протоколу производителя. Рисунок 2. Оценка качествa ДНК в библиотеке. 35 п.о. и п.о. - маркер. После затупления концов двуцепочечных фрагментов ДНК при помощи фермента (End Repair Enzyme) к образцу добавляют Ion Xpress Barcode и Ion Xpress P1 адаптеры и гибридизуют при температуре 25 С, 72 С в течении 15 и 5 мин, соответственно. ДНК очищают при помощи магнитных частиц AMPureXP. Подбор нужного размера ДНК 3

происходит при помощи коммерческого агарозного геля "E Gel" (ТhermoFisher, США). Гель с ДНК прогоняют по рекомендации производителя. Рисунок 3.

5 происходит при помощи коммерческого агарозного геля "E Gel" (ТhermoFisher, США). Гель с ДНК прогоняют по рекомендации производителя. Рисунок 3. Электрофорез для разделения ДНК при помощи "E Gel" Для получения 1 мкл 200 п.о. исследуемых ДНК нужно остановить электрофорез сразу, после того как 300-ая полоса маркера прикоснется к верхнему краю лунки. Не трогая дна лунки образцы собирают в LowBind (Eppendorf, Германия) пробирку при помощи автоматического дозатора. В лунку наливают по 10 мкл воды без нуклеаз и собирают в нее ДНК. Общий и конечный объем ДНК должен составлять 30 мкл. Таким образом, из двух лунок можно получить 60 мкл целевой ДНК. Полученные таким образом библиотеки ДНК амплифицируют по рекомендации производителя Ion Torrent, очищают при помощи AMPureXP (1.2х), измеряют концентрацию ДНК с помощью Qubit и оценивают качество ДНК с помощью Биоанализатора. Концентрацию библиотеки в пикомолях уточняют при помощи ПЦР в реальном времени Подготовка библиотек к секвенированию Развести исследуемые ДНК библиотеки в 70 мкл воды без нуклеаз до получения конечной концентрации библиотеки пm и налить в определенную лунку в автоматизированном роботизированном приборе Ion Chef (Life technologies, США). Прибор работает по инструкции производителя и после 10-часовой работы он загружает готовые образцы ДНК на два чипа, которые используются для секвенирования на приборе Ion Proton. 4